Prima Pagina » Sanatate A-Z » Gastroenterologie » Metode de Diagnostic ale Infectiei cu H. pylori

Metode de Diagnostic ale Infectiei cu H. pylori

Generalitati:

Testul respirator cu uree marcata are avantajul de a depista o infectie actualaInfectia cu H. pylori este asociata unei game largi de patologii, atat digestive cat si extradigestive, constituind un argument al investigarii sale atat in scop diagnostic cat si curativ. De aceea, au fost elaborate de-a lungul timpului diverse tehnici de depistare a microorganismului utilizate de prima intentie, pentru supravegherea eradicarii sale si de asemenea in cadrul studiilor epidemiologice.

Prezenta H. pylori la nivelul mucoasei gastrice poate fi detectata prin metode directe (invazive), metode indirecte (neinvazive ) sau prin combinarea diferitor tehnici.

Metodele conventionale de diagnostic al infectiei sunt:

1. Metode directe (invazive):

  • Testul rapid al ureazei;
  • Sectiuni histologice;
  • Diagnostic bacteriologic (frotiu sau cultura).

2. Metode indirecte (neinvazive):

  • Testul respirator cu uree marcata;
  • Serodiagnostic;
  • Polimerase Chain Reaction (PCR);
  • Detectarea Ag bacteriene in diverse produse biologice.

Nici una dintre tehnici nu a putut fi cotata ca metoda de referinta in stabilirea unui diagnostic, deoarece sensibilitatea lor este asemanatoare. De aceea, preferintele clinicienilor se indreapta spre combinatiile de doua sau mai multe teste, in functie de patologia implicata. Cand doua sau mai multe teste sunt pozitive, diagnosticul infectiei este de certitudine ( rezultat real pozitiv ); cand toate testele efectuate sunt negative se considera un rezultat real negativ; daca numai unul din teste este pozitiv, exceptand cultura care este de certitudine, diagnosticul este nesustinut si se trece la repetarea investigatiilor.

Trebuie retinut ca alegerea metodelor de investigare depinde de motivatia solicitarii (de exemplu coexistenta infectiei cu o patologie maligna sau predispozanta), de complianta bolnavului (endoscopie – biopsie) si nu in ultimul rand de considerentele economice. Metodele invazive sunt utilizate in special pentru diagnosticul initial al infectiei si pentru evidentierea leziunilor asociate, datorita gradului de disconfort produs fiind inlocuite cu testele neinvazive ( de exemplu testul respirator cu uree marcata ) in cazul necesitatii monitorizarii gradului de eficienta a unui tratament. in studiile epidemiologice de evaluare a prevalentei H. pylori pe grupe de varsta dintr-un teritoriu se folosesc examenele serologice.

Nu trebuie neglijat nici aspectul economic al acestor investigatii absolut necesare, deoarece raportul cost – beneficiu trebuie sa fie optim.

Metode invazive de diagnostic

In cadrul examenului endoscopic sunt prelevate fragmente de mucoasa gastrica din diferite portiuni ale acesteia care prezinta modificari (eroziune, inflamatie ). Piesele bioptice sunt supuse testului rapid al ureazei, examenului microscopic si cultivarii. Este esential ca pacientul sa nu fi urmat tratament recent cu antibiotice, bismut sau inhibitori de pompa protonica deoarece microorganismul poate avea o repartitie neuniforma la nivelul mucoasei si fragmentele prelevate vor furniza rezultate eronate (frecvent fals negative). In cazul in care bolnavului i-au fost administrati inhibitori de pompa de protoni, este recomandata prelevarea de esantioane din corpul gastric, unde pH – ul se mentine mai scazut.

H. pylori se localizeaza preferential la nivelul mucoasei antrale, de aceea se recomanda obtinerea de biopsii cu diametrul de aproximativ 2 mm prelevate din zona la 10-22 mm deasupra orificiului piloric. Numarul de biopsii variaza in raport cu posibilitatile tehnice de diagnostic.

Testul rapid al ureazei:

Metoda este deosebit de simpla, rapida si ieftina, putand fi efectuata chiar in sala de endoscopie. Este considerata cea mai populara tehnica si se bazeaza pe evidentierea ureazei preformate in piesa bioptica.

Principiul testului. Ureea in solutie sau incorporata in gel este treptat descompusa de ureaza preformata in esantionul prelevat cu care vine in contact. Se elibereaza amoniacul care va determina o crestere a pH – ului (culoarea indicatorului rosu fenol vireaza de la galben spre roz – rosu-violaceu). Reactia are loc la temperatura camerei si poate fi scurtata daca se creste temperatura la 37 -55°C. Prima citire a testului se face dupa 20-30 minute, apoi se repeta citirea la 1h, 2h, 3h, 4h si 24h.

Rezultate. Rezultatul pozitiv este obtinut cu atat mai repede cu cat numarul de bacterii prezente pe esantion este mai mare. Rezultate fals negative se pot obtine cand numarul de bacterii este insuficient sau daca pacientul a urmat in prealabil un tratament antibiotic. Rezultate fals pozitive la 24 de ore pot fi date de alte specii de bacterii producatoare de ureaza (Proteus, Klebsiella, Staphylococcus), mai ales daca acestea sunt favorizate de hipoclorhidrie sau aclorhidrie gastrica.

Performante. Sensibilitatea testului creste proportional cu intervalul de urmarire si ajunge la 100% la 24 de ore (98% conform Marshall si col.,1987). Specificitatea se apropie de 100% daca testul se pozitiveaza in primele 3 ore.

Primul test comercial aparut a fost CLOtest, utilizat si in prezent. Conform studiului efectuat de Marshall si col. in 1987 pe un esantion de 297 pacienti, CLO-test se pozitiveaza in 75% cazuri in 20 de minute fara a da rezultate fals pozitive. Pozitivarea la 1h este de 85%, la 3h de 90%, iar un procent de 5% se pozitiveaza pana in 24 de ore. Este recomandata prelevarea a doua esantioane de mucoasa si efectuarea a doua teste de acest gen deoarece H. pylori se poate gasi in numar mic, cu distributie anarhica sau daca exista zone intinse de metaplazie intestinala.

Examenul microscopic direct:

Metoda este si ea destul de simpla, ieftina si rapida, putand fi efectuata in laboratoare cu dotare minima si consta in identificarea H. pylori pe frotiul din esantionul bioptic colorat prin metoda Gram sau cu fucsina.

Principiu. Dupa prelevare, fragmentul bioptic este depus intr-un flacon cu solutie izotona de NaCl 0,9% pentru evitarea desicatiei probei pe parcursul transportului. Se poate utiliza si o solutie hipertona de glucoza 20% care previne detasarea stratului de mucus. Dupa fixarea frotiului prin caldura si colorarea cu fucsina Gram (5 minute), poate fi identificata morfologia caracteristica a H. pylori: bacili Gram, spiralati, mobili, cu 2 pana la 6 flageli unipolari, avand lungimea de 3 – 5 µm si diametrul de 0,5 – 1 µm, dispusi izolati sau grupati in stratul de mucus si in vecinatatea celulelor epiteliale. Pot apare de asemenea si forme atipice cocoide.

Performante. Sensibilitatea testului poate depasi valoarea de 80%, in functie de intervalul de timp acordat examinarii efective a frotiului. Specificitatea este relativa deoarece la nivelul mucoasei gastrice pot exista Campylobacter jejuni sau alte specii de Campylobacter de la nivelul mucoasei bucale care au o morfologie usor de confundat, mai ales in cazul probelor cu scor de colonizare mic. Combinarea cu testele de imunofluorescenta duce la identificarea corecta a microorganismului.

Evidentierea H. pylori in sectiuni histologice:

Desi este mai scumpa si mai inceata, aceasta metoda permite si evaluarea leziunilor histopatologice de la nivelul mucoasei gastrice.

Principiu. Conform sistemului Sydney de clasificare a gastritelor se recomanda prelevarea a cate 2 esantioane de mucoasa gastrica de la nivelul antral si al corpului gastric. Acestea trebuie introduse imediat in solutie de fixare (solutie formolizata sau solutie Bouin). Colorarea sectiunilor poate fi efectuata prin mai multe metode, cea mai utilizata fiind coloratia Giemsa modificata. Initial, Warren si Marshall au folosit tehnica de impregnare argentica, acum aceasta fiind considerata prea laborioasa si costisitoare.

Rezultate. Localizarea H. pylori trebuie cautata la nivelul suprafetei mucoasei gastrice, in cripte, in mucusul epitelial sau la nivelul celulelor epiteliale. Este importanta identificarea catorva bacterii cu profil caracteristic, un rol major avandu-l planul de sectiune. Densitatea bacteriana trebuie exprimata in buletinul anatomopatologic.

Sunt cautate si leziunile asociate, in majoritatea cazurilor acestea fiind de gastrita cronica activa, in special antrala. Infiltratul inflamator cu PMN este sugestiv pentru activitatea bacteriana. Se pot intalni si zone de metaplazie intestinala sau de degenerare maligna. H. pylori poate fi localizat la nivelul mucoasei duodenale in prezenta metaplaziei gastrice si lipseste de la nivelul mucoasei gastrice daca se asociaza metaplazia intestinala.

Performante. Sensibilitatea metodei poate depasi pragul de 90% in conditiile in care examinarea este facuta de un anatomopatolog experimentat. Specificitatea evidentierii H. pylori pe sectiuni histologice este asemanatoare cu metoda examinarii microscopice directe.

Evidentierea H. pylori pe medii de cultura:

Conditiile de prelevare si transport ale probelor bioptice sunt deosebit de importante in vederea asigurarii viabilitatii bacteriei si inlaturarii rezultatelor fals negative. Glutaraldehida care este utilizata la decontaminarea endoscopului si a forcepsului de prelevare are efect inhibitor sau bactericid asupra H. pylori, fiind necesara indepartarea sa printr-o spalare atenta.

Conservarea probelor pana la momentul insamantarii se efectueaza prin plasarea in solutie izotona de NaCl 0,9%, solutie hipertona de glucoza 20% sau in bulion tioglicolat si se mentin la o temperatura de4°C pentru maxim 6 ore. Intervalul de conservare poate fi prelungit la 48 de ore daca sunt utilizate mediile semisolide de transport (Stuart, Portagerm pylori). Daca se urmareste o conservare mai indelungata (de cateva luni), probele de lucru sunt plasate in apa peptonata 1% cu glicerol 25% si pastrate refrigerate la o temperatura de-70 °C. Inainte de insamantare, esantionul este pus in 0.5 ml de solutie izotona si omogenizat cu un triturator electric timp de 15 secunde la 10.000 de rotatii/min. Apoi sunt depuse cate doua picaturi din omogenizat pe suprafata mediilor de cultura si se disperseaza cu o ansa.

Mediile de cultura au cunoscut de-a lungul timpului multe modificari de formula, fiind utilizate medii gelozate (agar infuzie cord-creier, agar Columbia, agar Brucella, agar socolat cu adaos de 5-10% sange degradat termic). S-a optat ulterior pentru adaosul de 1% Isovitalex, un amestec de factori de crestere.

Pentru imbunatatirea rezultatelor se folosesc simultan medii selective cu antibiotice care impiedica dezvoltarea altor bacterii. La inceput a fost utilizat un amestec de Vancomicina, Trimetoprim si Polimixina B (suplimentul Skirrow). De utilizare mai recenta este suplimentul selectiv Dent cu Vancomicina (10mg/l), Trimetoprim (5mg/l), Cefsulodin (5mg/l), Amfotericina B (5mg/l).

Pentru o recunoastere mai usoara a coloniilor se inglobeaza TTC (trifenil tetrazoliu clorid, 40mg), permitand pigmentarea acestora in galben stralucitor. Dupa cum am mentionat deja, mediul ideal pentru cultura trebuie sa aiba un pH de 5.5 – 8.5 si o temperatura medie de 37 °C(H. pylori nu se multiplica sub 30o C sau peste 40°C).

Conditii de incubare. H. pylori creste in atmosfera microaerofila cu 5% O2, 5-10% CO2 si 95% umiditate, realizata intr-un recipient ermetic inchis, cu ajutorul unui generator chimic de gaze.

Timpul de urmarire a culturii. Majoritatea culturilor se pozitiveaza in 3 – 5 zile. Este necesara examinarea zilnica a placilor din a 2-a pana intr-a 7-a zi cand se inregistreaza rezultatul final. Daca probele bioptice au fost prelevate de la pacienti care au urmat un tratament antimicrobian recent, incubarea trebuie prelungita pana la 10 – 14 zile.

Criterii de identificare a coloniilor de H. pylori.

  • apar dupa minim 3 zile;
  • aspectul macroscopic: colonii de tip S translucide, de culoare galben stralucitor, cu diametrul de aproximativ 1 mm;
  • aspectul microscopic: pe frotiu apar bacili gram – negativi, drepti sau cu aspect ondulat ori incurbat. 

Avantajele cultivarii:

  • Specificitate de 100%;
  • Permite testarea sensibilitatii tulpinilor izolate la diferite antibiotice si monitorizarea individuala a raspunsului la tratamentul de eradicare;
  • Stabilirea identitatii tulpinilor in studii epidemiologice.

Detectarea H. pylori prin teste efectuate in vivo:

Relativ recent a fost elaborata o metoda care permite evidentierea H. pylori in timpul examenului endoscopic. Principiul testului se bazeaza pe reactia de culoare pe care o da un indicator de pH, administrat impreuna cu o solutie de uree 5%, in momentul in care aceasta este hidrolizata de ureaza bacteriana prezenta la suprafata epiteliului gastric. Indicatorul folosit in cursul primelor teste este rosu-fenolul, a carui culoare galbena in mediul acid vireaza la rosu-portocaliu odata cu cresterea pH-ului. Avantajele majore ale acestei tehnici ar fi evidentierea unei „harti” a zonelor colonizate, orientand astfel biopsia.

Metoda este inca in studiu si nu a intrat in uzul curent al clinicienilor, folosirea ei fiind limitata indeosebi de  echipamentele laborioase necesare.

Metode neinvazive de diagnostic

Metodele indirecte de diagnostic al infectiei cu H. pylori (testul respirator cu uree marcata, testele serologice, detectarea Ag bacteriene in materiile fecale etc) presupun evitarea endoscopiei si sunt lipsite de disconfort si de erorile de esantionare, neavand totusi posibilitatea de a depista patologia asociata fenomenelor dispeptice.

Testul respirator cu uree marcata:

Fata de celelalte metode neinvazive mentionate, testul respirator cu uree marcata are avantajul de a depista o infectie actuala. Metoda se bazeaza pe hidroliza ureei marcate cu 13C sau cu 14C de catre ureaza eliberata de H. pylori in cantitate mare. In urma reactiei se elibereaza NH3 si CO2 marcat. Acesta va fi absorbit in sange, ajunge in circulatia pulmonara si este eliminat in aerul respirat, unde este cuantificat.

Principiu. Dupa hidroliza ureei marcate cu 13C (izotop stabil, usor de manipulat ) se masoara cantitatea de 13CO2 in functie de raportul 12CO2/13CO2. Aerul expirat de pacient este captat in recipientul de colectare.

Etapele testului conform Standardului European:

  • Prelevarea probei initiale (nivelul de baza);
  • Administrarea pranzului test;
  • Dupa 10 minute pacientul ingera repede solutia de 100 mg uree marcata si dizolvata in 40-60 ml de apa;
  • Pacientul este apoi rugat sa adopte succesiv pozitiile de decubit lateral stang si drept (distributie uniforma a ureei marcate la nivelul stomacului);
  • Recoltarea probei: prelevarea a2 litride aer la 5 minute interval, timp de 30 de minute;
  • Etichetarea tubului de colectare si expedierea la laborator.

Rezultate. Specificitatea testului este influentata de alte bacterii producatoare de ureaza de la nivelul mucoasei gastrice si bucale. Pot apare rezultate fals negative in cazul administrarii relativ recente de bismut, antibiotice sau inhibitori de pompa de protoni. Aceeasi situatie se poate intalni si la pacientii gastrectomizati care prezinta retentie insuficienta de uree marcata.

Factorii care influenteaza rezultatul testului tin de: testul ca atare, gazda si de bacterie in sine:

Factori dependenti de test

Eliminarea rapida a ureei din continutul gastric duce la hidroliza sa incompleta si furnizeaza rezultate fals negative. In scopul evitarii acestui fenomen se administreaza pranzul – test. Majoritatea pranzurilor incetinesc evacuarea stomacului si ar putea fi utilizate daca indeplinesc urmatoarele conditii: gust placut (pentru obtinerea compliantei pacientului), cost scazut, timp de injumatatire lung si neinfluentarea dispersiei ureei marcate. Este recomandata utilizarea acidului citric (21 g dizolvate in 100 ml apa distilata), care scade pH – ul gastric si intarzie evacuarea.

Acidul citric provoaca relaxarea imediata a regiunii fundice si inhibitia motilitatii antrale chiar la o administrare in cantitate mica (1 ml). De asemenea, creste procentul de rezultate pozitive prin inhibarea activitatii ureazei la nivelul mucoasei bucale. Cantitatea de uree administrata trebuie sa asigure saturarea ureazei produse de bacterie. Trebuie retinut ca, spre deosebire de alte bacterii producatoare de ureaza prezente la nivelul tractului digestiv, H. pylori produce ureaza superioara cantitativ si cu afinitate mai mare pentru uree. 

Factori dependenti de gazda

Tratamentul prealabil cu antibiotice, bismut sau inhibitori de pompa protonica se poate solda cu rezultate fals negative. Motilitatea gastrica individuala poate determina si ea rezultate fals negative, de aceea unele protocoale de efectuare a testului includ recomandarea ca ultimul pranz anterior testului sa fie administrat cu cel putin 4 ore inainte. Bacteriile comensale de la nivelul orofaringelui furnizeaza rezultate fals pozitive daca proba este efectuata in primele 10 minute de la ingestia ureei.

Factori dependenti de H. pylori

Colonizarea redusa a mucoasei de catre unele tulpini poate genera rezultate fals negative (scade cantitatea de ureaza produsa). Rarele forme cocoide, avand un metabolism extrem de redus duc la obtinerea acelorasi tipuri de rezultate, astfel incit nu pot fi diagnosticate prin aceasta metoda.

Exista acum o multitudine de teste comerciale care rezolva o mare parte din aceste probleme, inlaturand majoritatea factorilor raspunzatori de obtinerea rezultatelor fals negative. Helicobacter Test INFAI este primul test cu uree marcata cu 13C omologat de Uniunea Europeana (din 1997). Are indicatii relativ largi, putand fi administrat si la pacientii cu gastrectomie. Studiile efectuate au observat ca rezultatele sunt neconcludente in cazul antecedentelor recente de tratament cu antibiotice sau inhibitori al secretiei acide. Durata testului este scurta, de doar 40 de minute, iar cantitatea de uree marcata este scazuta la 75 mg. Se recomanda ca ultimul pranz administrat sa fie la cel putin 6 ore distanta de efectuarea testului. Initial, este masurat nivelul de baza prin prelevarea aerului expirat de bolnav in doua recipiente speciale ermetic inchise. Ulterior se administreaza ureea marcata cu 13C: pacientul ingera 200 ml de suc de portocale natural (contine acid citric), apoi este administrata imediat solutia testului (75 mg uree marcata dizolvata in 30 ml apa). Dupa 30 de minute se preleveaza a doua proba de aer expirat in doua recipiente. Tuburile sunt apoi etichetate si expediate catre un laborator specializat.

Rezultate. Sensibilitatea (97.9%) si specificitatea (98.5%) testului Helicobacter Test INFAI sunt comparabile cu cele ale metodelor invazive. Testul poate fi utilizat si in monitorizarea eficientei tratamentului de eradicare a infectiei cu H. pylori prin repetarea sa dupa minim 4 saptamani de la instituirea tratamentului.

Teste serologice:

In urma infectiei cu H. pylori, in sange, saliva, urina sau la nivelul mucoasei gastrice pot fi decelati Ac specifici. Raspunsul sistemic este de tip Ig G si in procentaj foarte mic de tip Ig A, care predomina la nivel local. Exista mai multe teste serologice care apreciaza raspunsul imun: aglutinare, reactia de fixare a complementului, hemaglutinare pasiva, imunofluorescenta, imunoenzimologie (reactia ELISA). Cea mai frecvent utilizata este ELISA din considerente de simplitate, rapiditate si eficienta.

Rezultate. Sensibilitatea si specificitatea testului ELISA depind de natura Ag utilizat. Unele specii (mai ales Campylobacter) pot determina reactii incrucisate. Sensibilitatea testului poate fi scazuta daca sunt utilizate antigene purificate sau recombinate. Se recomanda Ag native sau semipurificate in combinatie cu Ag purificate. In marea majoritate a cazurilor testul ELISA are o specificitate de peste 90%, indiferent daca este efectuat cu reactivi de laborator sau cu preparate comerciale.

Unul din testele comerciale utilizate pe scara larga este CLOser rapid, cu o durata de numai 10 minute. Metoda detecteaza nivelul seric sau plasmatic al Ac specifici pentru H. pylori. Rezultatul este obtinut rapid, urmand cele 4 etape indicate. Fiecare test este precalibrat de catre producator prin utilizarea de ser standardizat (creste capacitatea de discriminare intre valori apropiate ale titrului seric de Ac). Sensibilitatea testului este de 93.5%, iar specificitatea de 100%.

Ca alternativa la celelalte metode de serologie, au aparut preparate comerciale rapide, calitative (latex aglutinarea), ce pot fi efectuate cu sange integral: Flex Pack Helicobacter pylori, Helisal One-Step, Pyloriset Screen etc. Este necesar de mentionat si testul Autotest Helicobacter folosit pentru determinarea Ac salivari, utilizat in prezent pe scara larga in Occident.

Avantajele metodelor serologice:

  • Utilizarea in studiile epidemiologice (metode ieftine, rapide);
  • Sunt neinvazive;
  • Monitorizarea eficientei tratamentului de eradicare a infectiei.

Detectarea Ag in materiile fecale:

Metoda este de data recenta si este folosita pentru urmarirea eficientei tratamentului de eradicare la o luna de la intreruperea acestuia. Rezultate. Sensibilitatea si specificitatea testului sunt comparabile cu rezultatele obtinute de testul respirator cu uree marcata, constituindu-se ca alternativa de investigatie a infectiei cu H. pylori prin metode neinvazive.

Detectarea H. pylori prin PCR (Polimerase Chain Reaction):

Metoda este deosebit de eficienta, unele studii aratand o sensibilitate mai mare decat a examenului microscopic sau culturii. Probele biologice pot fi reprezentate de biopsii gastrice, saliva, materii fecale sau bila. Avantajele metodei, pe langa sensibilitatea ridicata si specificitatea de 100%, constau in posibilitatea evidentierii in acelasi timp si a unor factori de virulenta (de exemplu, gena pentru cagA), precum si in identificarea cu precizie a localizarii intra sau extracelulare a bacteriei. Dezavantajul major al metodei in constituie costul extrem de ridicat, ceea ce face adresabilitatea foarte scazuta.

Articole Similare:

Ultima actualizare: marți, 27 noiembrie, 2012, 10:59

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată. Câmpurile necesare sunt marcate *